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    Nature熱評:CRISPR正推動CAR-T細胞快速前進

    發布時間:2021-03-09

    隨著人們對免疫治療興趣的增長,對更好的CAR-T細胞制造工具的需求也在增長。CRISPR技術的進步能解決這個問題嗎?


    在過去的十年里,一種新的免疫治療工具進入了臨床。被設計成表達嵌合抗原受體的T細胞,即CAR-T細胞,已經被證明可以幫助血癌患者。2011年的一項關鍵研究使用第二代CAR-T細胞來實現大多數測試患者T細胞的持續激活和緩解。


    一年后出現了另一個重大突破,兩個小組描述了一種名為CRISPR-Cas9的新型基因編輯工具,并演示了它在真核細胞中的應用。這兩份報告幫助開啟了基因編輯的新時代。


    盡管基因編輯有可能改善細胞工程,但CAR-T細胞和CRISPR的交叉還需要幾年時間。



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    尋找方法


    從一開始,CAR - T細胞就顯示出了巨大的殺癌潛力,但制造這些細胞既繁瑣又復雜。

    最初,T細胞工程依賴于慢病毒或逆轉錄病毒載體將DNA片段導入細胞進行同源重組。病毒載體允許DNA片段的穩定整合和長期表達。然而,獲得這些載體所需的臨床級試劑非常昂貴,而且這些載體只能攜帶有限數量的DNA,而這些DNA有可能隨機整合到基因組中。

    為了推進CAR-T細胞治療,研究人員需要找到一種更有效的方法來設計長CAR序列。



    CRISPR驅動CAR的發展

    從一開始,CRISPR就像是制造T細胞的理想方法。這是一個簡單的過程,具有最小的脫靶效應,適用于多種細胞類型。但CRISPR在一個領域遇到了困難。

    CRISPR-Cas9通過產生靶向雙鏈DNA (dsDNA)斷裂,然后通過細胞的非同源末端連接途徑修復,從而有效地產生小的突變。然而,當使用同源導向的修復機制插入外源DNA時,CRISPR編輯的效率可能低得可憐。然而,插入DNA對于制造CAR-T細胞至關重要。

    位于奧馬哈的內布拉斯加大學醫學中心(University of Nebraska Medical Center)的基因工程師Channabasavaiah Gurumurthy表示:"Easi-CRISPR是一種更好的工具,適用于同源性導向修復。"

    Gurumurthy和他的合作者發現,當使用CRISPR將DNA插入細胞時,長單鏈DNA (ssDNA)是比雙鏈DNA更有效的模板。使用Easi-CRISPR,長ssDNA與含有Cas9和導向RNA的預組裝復合物一起被注入,導致更高的靶標編輯率和更低的脫靶編輯率。之前的報道顯示,化學合成的具有2-甲氧基和硫代磷酸基團修飾的單導向RNA (sgRNA)增強了原代細胞的細胞內穩定性和編輯效率。此后,CRISPR-Cas9似乎開始成為T細胞內產生缺失和插入的有效工具。

    去年,Alexander Marson、Gurumurthy和他的同事們利用Easi-CRISPR對人類T細胞的結構和功能進行了重新編程,且不需要病毒載體。本研究表明,將ssDNA作為同源性導向的修復模板對T細胞進行CRISPR編輯,與dsDNA模板相比,能夠更準確、更有效地進行大規模的基因插入,并且脫靶整合概率更低。



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    展望未來


    雖然有希望,但還有一個重要的考慮。"長ssDNA序列很難在實驗室中產生,尤其是在基因編輯實驗中需要高濃度的長ssDNA," Marson實驗室的成員、該研究的第一作者Theodore Roth說。

    一些公司和研究開發人員正試圖解決這個問題,他們正在研究有效生成大量長ssDNA的方法??偛课挥谛聺晌髦萜に箍ㄋf(Piscataway)的全球生物技術公司GenScript以其領先的DNA合成技術而聞名。該公司最近開始提供數千個核苷酸長度的ssDNA,數量可達100微克--這是使用CRISPR進行T細胞重編程的理想選擇。GenScript也是為數不多的提供完整的CRISPR解決方案的公司之一,包括HPLC純化的、化學合成的sgRNAs,并通過末端修飾來增強CRISPR編輯。

    基因編輯正在改變研究人員研究細胞工程的方式。像Easi-CRISPR這樣的方法,連同DNA和RNA合成的改進,將進一步加強CAR-T細胞工程的努力,最終改善癌癥治療和人類健康。(生物谷Bioon.com)

    參考資料:
    【1】CRISPR expands CAR T cell possibilities
    【2】Porter, D.L., et al. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N Engl J Med 365, 725-733 (2011). DOI: 10.1056/NEJMoa1103849
    【3】Jinek, M., et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 3337, 816-812 (2012). DOI: 10.1126/science.1225829
    【4】Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819-823 (2013). DOI: 10.1126/science.1231143
    【5】Miura, H., et al. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13, 195-215 (2018). DOIhttps://doi.org/10.1038/nprot.2017.153
    【6】Hendel, A. et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol. 33, 985-989 (2015). DOIhttps://doi.org/10.1038/nbt.3290
    【7】Roth, T.L., et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559, 405-409 (2018). DOI https://doi.org/10.1038/s41586-018-0326-5
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